哈佛醫(yī)學(xué)院著名遺傳學(xué)家George Church教授是基因編輯技術(shù)的鼻祖之一：2年前張鋒使用CRISPR技術(shù)完成了多重基因組編輯，Church則使用CRISPR技術(shù)完成了RNA介導(dǎo)的人類基因組編輯。

自此之后，CRISPR/Cas9技術(shù)持續(xù)火爆，方便快捷的方式迅速風(fēng)靡科研界，不論是醫(yī)學(xué)研究，農(nóng)學(xué)研究，微生物研究，都對(duì)其投入巨大精力。迄今為止，從PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢，關(guān)于Cas9的文章共有951篇，其中最新的一篇是9月7日的Nature子刊——Nature Methods報(bào)道了哈佛大學(xué)和麻省理工的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了雙重功能的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因組編輯和基因調(diào)控。

過(guò)去：基因編輯和基因調(diào)控需要用到不同的Cas9蛋白

眾所周知，Cas9是蛋白R(shí)NA復(fù)合物，其中的小型引導(dǎo)RNA識(shí)別特定DNA序列的能力。不論是基因編輯還是基因調(diào)控，CRISPR-Cas9的第一步是相同的：引導(dǎo)RNA通過(guò)序列互補(bǔ)原則將Cas9帶到基因組特定位點(diǎn)，使其與目的基因結(jié)合。不過(guò)到目前為止，基因編輯和基因調(diào)控需要用到不同的Cas9蛋白。基因編輯依賴Cas9的DNA剪切活性；而基因調(diào)控需要抑制其剪切活性，只保留Cas9結(jié)合靶標(biāo)基因的能力。在過(guò)去，基因調(diào)控所用的Cas9變體通常與調(diào)控基因表達(dá)的蛋白融合在一起。

雙重功能的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，可同步實(shí)現(xiàn)基因編輯和調(diào)控

哈佛大學(xué)的George Church教授和麻省理工的Ron Weiss教授共同領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一個(gè)新策略，成功用一種Cas9同時(shí)完成基因編輯和基因調(diào)控兩項(xiàng)任務(wù)。gRNA又稱引導(dǎo)RNA，真核生物中參與RNA編輯的具有與mRNA互補(bǔ)序列的RNA。引導(dǎo)RNA為模板的插入編輯，即RNA編輯所需要的信息或者來(lái)自向?qū)NA，或者來(lái)自被編輯的RNA自身。

引導(dǎo)RNA的編輯過(guò)程

CRISPR/Cas9的成功與否的關(guān)鍵問題在于gRNA的設(shè)計(jì)，gRNA和非目標(biāo)區(qū)域過(guò)多的非特異性結(jié)果，脫靶效率較高，特別是靠近PAM的8-10bp不能和非目的區(qū)有高同源性。目前為了提供基因組操作的準(zhǔn)確性，對(duì)Cas9核酸酶進(jìn)行了突變，突變后的Cas9n 只能切割DNA雙鏈中的一條鏈，通過(guò)兩個(gè)gRNA引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA切割：gRNA-I首先以其5’端與前體RNA互補(bǔ)配對(duì)，從3’向5’方向插入U(xiǎn)MP；gRNA-II繼續(xù)完成編輯的全過(guò)程。該方法可以顯著提高基因組編輯的特異性，降低脫靶效率。

選擇適合的引導(dǎo)RNA的長(zhǎng)度是關(guān)鍵

文章的第一作者之一Alejandro Chavez博士表示：在決定Cas9結(jié)合DNA之后是否進(jìn)行切割過(guò)程中，引導(dǎo)RNA的長(zhǎng)度起到了關(guān)鍵性作用；過(guò)度截短引導(dǎo)RNA使Cas9不能切割其基因組靶點(diǎn)；不過(guò)截短引導(dǎo)RNA并不影響Cas9與靶基因的結(jié)合。人們可以在此基礎(chǔ)上，用Cas9把基因調(diào)控蛋白送到特定的基因上，即在此基礎(chǔ)上改造的引導(dǎo)RNA和化膿性鏈球菌的Cas9蛋白，在切割特定基因的同時(shí)也可調(diào)控其他基因的表達(dá)。

雙功能CRISPR-Cas9發(fā)現(xiàn)的實(shí)際應(yīng)用意義

Church教授表示，以后人類可以根據(jù)引導(dǎo)RNA的最適合長(zhǎng)度原則，用一種蛋白獲得對(duì)基因序列和基因表達(dá)的直接控制，使得幾乎所有DNA都能轉(zhuǎn)變?yōu)檎{(diào)控序列，從而進(jìn)一步操縱細(xì)胞。其實(shí)際應(yīng)用意義有2方面：一是揭示重要過(guò)程背后的復(fù)雜互作（比如癌癥耐藥性和干細(xì)胞分化）；二是設(shè)計(jì)更高級(jí)的人工基因回路。

文章的一位共同作者M(jìn)arcelle Tuttle博士則表示，雙功能CRISPR-Cas9可以提升破解致病基因之間的復(fù)雜關(guān)系的能力；還可以用于工業(yè)領(lǐng)域，促進(jìn)基因工程菌株（E. coli等）大規(guī)模生產(chǎn)化合物和燃料，同時(shí)保護(hù)這些菌株不被其他病原體感染。

Wyss研究所的Donald Ingber博士說(shuō)認(rèn)為，此項(xiàng)研究顯著提高了CRISPR-Cas9的控制水平，進(jìn)一步拓展了這一系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。